miRNA实时定量检测服务
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miRNA实时定量检测服务

microRNA简介

microRNA(miRNA)是一类进化上保守、内源性、长度为20-24个核苷酸的非编码RNA。成熟的miRNA可识别一种或多种mRNA,降解靶mRNA或者阻遏其翻译。miRNA在细胞生长与发育过程中起多种作用,包括发育、疾病、细胞增殖与凋亡等。

基于实时荧光定量PCR技术对miRNA是实验室最常用的检测方案。主要分为:Stem-Loop引物逆转录结合SYBR Green荧光染料PCR法及Poly(A)加尾逆转录结合SYBR Green荧光染料PCR法。

Stem-Loop引物逆转录结合SYBR Green荧光染料PCR法:

Stem-Loop引物逆转录结合SYBR Green荧光染料PCR法因逆转录的特异性,检测灵敏度高,也可特异性地分辨出miRNA 5p3p形式,及各种前体。

Poly(A)加尾逆转录结合SYBR Green荧光染料PCR法:

 Poly(A)加尾逆转录结合SYBR Green荧光染料PCR法可一次性对RNA样本逆转录出多种miRNA,适合多种miRNA定量检测,但该方案检测灵敏度低,且不能区分剪接成熟体(5p3p)。

本公司以Stem-Loop引物逆转录结合SYBR Green荧光染料PCR法为主要的实验方法提供miRNA定量服务。

技术原理

第一步:基于Stem-Loop引物的逆转录反应;

第二步:通过SYBR法实时检测PCR产物。(图1所示) 

 

 技术特点

  特异性好:可有效区分成熟miRNA5p3p形式;

  效率高:可对多个miRNA同管逆转录,节约样本资源与反应成本;

  检测分辨度高:可有效分辨低至10%的表达量差异(图1);

  重复性好:在对已知浓度miRNA进行梯度稀释后,线性关系好R20.99(图2);

  准确性高:一个或多个参照基因与检测基因在同一管内RT反应,定量检测后校正表达量;

利用本方法对野生型小鼠30-6与转基因小鼠30-126-426-626-7的丘脑(H)与卵巢(Omir5053p5p两种形式进行定量检测,扩增曲线如下图和转基因相对表达量如右柱状图示。