细胞迁移、侵袭检测服务
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细胞迁移简介

细胞迁移 (cell migration) 也称为细胞爬行、细胞移动或细胞运动,是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。细胞迁移为细胞头部伪足的延伸、新的黏附建立、细胞体尾部收缩在时空上的交替过程。细胞迁移是正常细胞的基本功能之一,是机体正常生长发育的生理过程,也是活细胞普遍存在的一种运动形式。胚胎发育、血管生成、伤口愈合、免疫反应、炎症反应、动脉粥样硬化、癌症转移等过程中都涉及细胞迁移。细胞迁移实验是研究肿瘤细胞转移程度的经典试验,主要包括Transwell实验和细胞划痕实验),在研究肿瘤细胞转移的文章中出现频率极高。

 

Transwell实验
Transwell是一类有通透性的杯状的装置,放入培养板后,分为两室:Transwell小室内称上室,盛装上层培养液;培养板内称下室,盛装下层培养液。上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。细胞种在上室内,因聚碳酸酯膜有通透性,故可研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

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图一 Transwell装置图示

实验流程

一、 材料准备
可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶的(CosterCorning公司的也较常用)Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套,BD公司的Matrigel,无血清DMEM(1%胎牛血清)DMEM1640培养基,DMEM完全培养基,1640完全培养基(也可加到20%血清),无菌PBS,棉签,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0.1%g/mlPBS结晶紫)

 

二、实验步骤(细胞迁移)

制备细胞悬液

l  制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿1224h,进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。

l  消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用PBS12遍),用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1-5×10^5/ml

接种细胞

l  取细胞悬液200µl2-5×10^4/well)加入Transwell小室。

l  24孔板下室一般加入600µl20%PBS的培养基,特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。

l  培养细胞:常规培养1248h,一般24h较常见,根据待测细胞的迁移能力强弱调整细胞数和迁移时间。

三、实验步骤(细胞侵袭)

基质胶铺板

l  Matrigel4℃过夜融化。

l  水化基底膜:每孔加入70ul含无血清培养液,37℃30min,吸去培养基。

l  实验时将所用的枪头在冰上预冷半个小时,用4℃预冷的无血清培养基按18稀释(稀释至1mg/mlMatrigel,冰上操作。

l  Transwell chamber上室底部中央垂直加入100μl稀释后的Matrigel37℃温育45小时使其干成胶状。

制备细胞悬液

l  制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿1224h,进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。

l  消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用PBS12遍),用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1-5×10^5/ml

接种细胞

l  取细胞悬液200µl2-5×10^4/well)加入Transwell小室。

l  24孔板下室一般加入600µl20%PBS的培养基,特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。

l  培养细胞:常规培养1248h,一般24h较常见,根据待测细胞的迁移能力强弱调整细胞数和迁移时间。

结果统计
直接计数法,贴壁细胞计数,这里所谓的贴壁是指细胞穿过膜后,可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去,通过给细胞染色,可在镜下计数细胞。

l  取出Transwell小室,弃去孔中培养液,用无钙的PBS2遍,甲醇固定30分钟,将小室适当风干。

l  1%结晶紫染色20 min,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞,用PBS3遍。

l   400倍显微镜下随即五个视野观察细胞,记数。

结果示例

服务流程