3’UTR报告基因系统构建
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3’UTR报告基因系统构建

基因表达水平主要取决于以下几个方面:

1.基因表达的启动:启动子是否被启动,表达;

2.RNA水平的修饰:RNA剪接;RNA的转运;RNA稳定性(比如miRNA或者LncRNA特定情况下对mRNA的调控);

3.蛋白水平的调节:翻译抑制,蛋白稳定性与酶解。

miRNA通过碱基互补配对的方式识别靶基因的3UTR区,并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。因此,可以将目的基因的3UTR区域构建到含luciferase的报告基因上,通过比较miRNA过表达或inhibitor 与报告基因作用检测荧光值的变化,判断miRNA对靶基因的作用。再通过对3 UTR区进行定点突变的方法进一步确定miRNA与靶基因3UTR的作用位点。miRNA对靶基因功能的调控是当前研究的热点。通过利用荧光素酶报告基因检测实验寻找或验证miRNA对靶基因的调控作用是当前最常用的技术。

上海翼和生物采用荧火虫荧光素酶(Firefly Luciferase)和海肾荧光素酶(Rellina Luciferase)组成双荧光素酶报告基因实验系统(Dual-Luciferase Reporter Assay)。实验中海肾荧光素酶与基因表达的特定实验条件相关,荧火虫荧光素酶用来做转染的内参,以校正不同样品之间转染的转染效率。萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶不需要翻译后修饰即具有生物活性,一旦翻译完成即具有报告基因的功能。通过加入特定的荧光素酶底物,荧光素酶与底物反应过程中会发出生物荧光,然后可以通过荧光测定仪测定反应过程中释放的生物荧光。

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