Western blot检测服务
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Western blot检测服务

蛋白质印迹(Western blotting),是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有 SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性,现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白,并能对蛋白进行定性和半定量分析。结合化学发光检测,可以同时比较多个样品同种蛋白的表达量差异。

 实验内容

1.蛋白提取和定量(如果提供蛋白样品,则直接电泳预实验检测抗体特异性);

2.SDS-PAGE 10-15% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;

3.转膜(PVDF膜);

4.封闭(5%脱脂奶粉);

5.一抗孵育(其中内参基因为TubulinGAPDHActin);

6.二抗孵育(如果由于材料降解或一抗造成实验无法继续,则收取相关预实验费用);

7.显色(ECL);

8.曝光、洗片、分析。

翼和优势 

l  多年Western Blot检测经验,提供专业的技术服务。高效蛋白提取液进行高质量蛋白的提取,同时高效的蛋白酶抑制剂有效防止蛋白的降解及去磷酸化等作用;

l  提供完整的实验步骤和结果,提供专业的数据分析,以及灰度值分析。

l  为客户设置预实验,根据客户样品具体情况摸索最适上样量和抗体最适稀释度。

样品要求

客户需提供新鲜或正确保存的蛋白样品或者蛋白提取液,阳性对照样品(细胞或组织), 检测目的蛋白的一抗(可由我公司代购)。样品要求为:

1.细胞不少于5×10^6个;

2.组织样品不少于50mg

3.总蛋白浓度不低于 2μg/μl(至少50μl)。

Western Blot细胞蛋白样本的准备及运输

细胞去掉培养液,用PBS洗一次后,加入少量PBS,用细胞刮将细胞刮下,用1ml枪吸取细胞易于1.5ml EP管中,快速离心去除上清后,可按下面两种方法运输:

1、细胞沉淀运输:将细胞沉淀放入液氮速冻,-80℃保存如需长途过夜运输,建议干冰运输;如当天送达样本,可用液氮或者-80冰袋运输。

2、细胞裂解液运输:加入一定量的胞裂解液后即可冷藏运输(冰袋或者冰盒)。如需检测磷酸化蛋白,建议裂解液中加入终浓度1mMNaFNaF可抑制磷酸酶活性,保护蛋白磷酸化水平。如果加入裂解液后提取蛋白,则置于冰上裂解1 h12000rpm离心10 min后取上清,即为蛋白样本。蛋白样本可-20度冷藏运输(建议快递寄送用干冰或者足量-80度冰袋),保存需要-80℃。

3、蛋白样本运输:蛋白样本需要经过浓度测定,再进行变性,变性时先加入Sample buffer,再95 10 minSample buffer可防止变性导致的蛋白沉淀析出。变性的蛋白可直接冷藏运输,-20℃稳定保存。