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目标区间重测序—PostGWAS研究之利器 (上篇)

原创: 茜美人 上海翼和生物 4月28日

 

GWAS面临的挑战

全基因组关联分析(Genome-wide association study, GWAS)已经发现了大量疾病和数量性状相关的基因和SNP。但是,相对于大量的GWAS数据,被验证的阳性结果仅占很小的一部分,只解释了部分遗传力。

GWAS丢失遗传力的原因主要有3个方面:

首先,GWAS本身是利用大规模SNP信息进行的队列研究,是基于多重假设的统计模型进行的分析。模型本身要求在进行大量位点的关联分析时,P值要非常小(通常为P<10E-08),才能获得可靠的阳性结果,但P值设置阈值过低会带来较多的假阴性结果(相关阳性位点的遗漏)。

其次,GWAS本身是一种关联分析,关联的阳性位点不一定是真正的致病位点,可能只是一个标签SNP,是由于附近存在真正的致病位点或稀有变异的累加效应导致TagSNPGWAS分析中可检测到阳性信号,真正起作用的casual基因或变异可能距离阳性信号位点很远,并具有更低的等位基因频率。

第三,复杂性状受到基因-基因,基因-环境的相互作用的影响, GWAS分析很难将上述重要的影响因素考虑进去。


二代测序带来的机遇

二代测序成本的降低,为GWAS结果的大规模重测序验证提供了契机。后GWAS时代的主要任务是在大规模人群样本中对候选基因进行深度测序,获取目标区间/基因的全部序列变异,然后对变异进行注释,找到真正的致病位点。这有别于其他TagSNPcase-control关联分析、模式动物的研究方法,是变异-疾病相关的直接证据,找回GWAS丢失遗传力的方法之一。

目前针对目标区间重测序的技术主要有Sanger测序(一代测序)、探针杂交捕获建库+第二代测序技术(Next Generation Sequencing, NGS)和多重PCR捕获+NGS3种方法。多重PCR捕获+NGS技术5kb-200kb区间高深度测序,进行序列分析具有无与伦比的优势。主要表现在3点:第一,多重PCR扩增建库可高效的捕获目标区段,一次PCR过程中捕获所有目标片段,实验流程方便、快捷,大大降低了捕获成本;第二,可以添加不同的barcode区分不同的样本,一次上机可以对海量的样本目标区间进行序列分析,降低了测序成本。数万元的经费,就可以完成上千样本数个候选基因的重测序。第三, SNP\Indel信息提取的生信分析软件已经趋于成熟稳定,可适用于各种二代测序平台的序列变异分析。这些优点都提高了二代测序应用于大队列样本序列分析的可行性。

目标区间重测序与SNP分析的不同

目标区间重测序属于直接分析,SNP是间接分析。重测序可以对目标基因外显子上的变异进行功能注释,评估每个变异对蛋白结构的影响,从而得出基因与疾病的相关性和致病位点;SNP分析,是间接分析,需要借助对照组和病例组的详细的病理资料进行分层分析,风险估计。SNP分析得到的是TagSNP所代表的block内所有位点的综合效应,无法找到真正的致病位点。

对候选基因在大队列样本中进行序列分析,不同于基于SNP与复杂疾病关联性的间接分析,序列分析是一种直接的分析手段,可直接分析发生在基因外显子区、调控区的核苷酸变异对基因编码的蛋白结构的影响或者对基因表达的影响,以此推测候选基因与血脂调控的关系,变异在大队列样本的种类及其分布,相关的成果,可直接应用于临床。

本公司专利技术Hi-Reseq

上海翼和生物目标区段重测序服务采用翼和自主研发的多重PCR技术,克服扩增效率不均一问题,保证每个扩增子间拷贝数差异控制在平均深度的5-10倍(利用ABI7900定量PCR检测多重PCR产物,根据CT值判读产物浓度,确保产物间的均一性),90%扩增子reads数大于15,不浪费测序通量,也可根据客户需求,加大测序深度。

https://mmbiz.qpic.cn/mmbiz_png/ABic5mdKAMqGQ8POxQs7pY9iaodqWdZ66vTdASP5icuNicicHecvX3Hbpce0TGmUxG1kRibzUY5Uapib2LUictSU0lWxUw/640?wx_fmt=png&tp=webp&wxfrom=5&wx_lazy=1&wx_co=1

 

数据分析内容

·      测序数据质量评估

·      测序覆盖度和深度报告

·      数据比对 ,变异分布统计

·      SNP/InDel检测、统计、注释

高级分析

·      变异位点功能注释;

·      表达调控区变异功能注释;

·      等位基因数、有效等位基因数、Private allele、杂合度、期望杂合度、多态性信息含量(PIC)、分子遗传变异方差分析、基因流、二维主坐标分析PCA;

·      连锁不平衡分析;

·      单倍型分析、单倍型Network分析

·      卡方检验、logistics回归分析                  

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