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海洋生物靶向目标基因重测序研究方案----翼和专利Hi-Reseq 2019第一弹

茜美人 上海翼和生物 3月18日

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文献来源

https://doi.org/10.1016/j.cbpb.2018.11.006

物种

马氏珠母贝 Pinctada fucata martensii

重要的海水养殖贝类和生产珍珠的主要母贝。国际上公认中国出产的南海珍珠(即马氏珠母贝所产珍珠)的质量在世界上首屈一指。

目标基因

β-胡萝卜素-15,15-加双氧酶基因(PmβCDOX)

该基因是将类胡萝卜素转化为维生素A的关键酶,对动物的消化吸收、代谢转运、生长发育以及免疫调节有着重要影响。

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研究目的

(1)克隆PmβCDOX基因;

(2)挖掘PmβCDOX基因多态性位点、分析SNP位点与胡萝卜素含量的相关性

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研究方法

1)样本

 cDNA克隆用样本马氏珠母贝适量。

目标测序用马氏珠母贝220个个体用于提取DNA,并测定胡萝卜素含量。

2PmβCDOX基因-cDNA克隆

特异引物PCRRACE相结合的方式,获取PmβCDOX基因完整cDNA

3PmβCDOX基因-Promoter区测序

个别样本采用克隆+一代测序方式获得promoter区序列。

4PmβCDOX基因-mRNA定量

采用经典qPCR法定量不同个体PmβCDOX基因表达量。

5)靶向PmβCDOX基因测序

220个个体,送至上海翼和应用生物有限公司测序,测序方法为公司专利技术Hi-Reseq。主要流程包括如下:

6)生物信息分析与统计

单因素方差分析用于比较基因含量。

Genbank用于blast比对,Expasy用于查看domainmotifMega用于构建进化树。启动子区分析采用Promoter Scan

多样性指数分析采用Popgene,分析参数包括HeHo、等位基因频度、PIC

Haploview软件构建单倍型。

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研究结果

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文中图标示例

翼和专利技术Hi-Reseq

基于发夹修饰引物的多重PCR捕获建库+第二代测序技术

在后基因时代,对基因组候选区段或候选基因的重测序的需求日益增加,候选区段范围在5K-200K之间,采用传统的Sanger测序或目标区域探针杂交捕获测序价格昂贵。基于超高重PCR的扩增子捕获测序应对该长度范围内的适用性更强!针对连续或不连续区段,外显子靶标以及客户指定区间,设计特异性引物,经过引物优化及修饰,多重PCR一次性捕获所有目标区间。比全基因组重测序,全外显子组测序,目标基因/区段测序更加灵活、经济、高效。

上海翼和生物目标区段重测序服务采用翼和自主研发的多重PCR技术,克服扩增效率不均一问题,保证每个扩增子间拷贝数差异控制在平均深度的5-10倍(利用ABI7900定量PCR检测多重PCR产物,根据CT值判读产物浓度,确保产物间的均一性),90%扩增子reads数大于15,不浪费测序通量,也可根据客户需求,加大测序深度。

应用方向:

医口:孟德尔遗传性疾病的筛查和诊断

复杂疾病致病基因筛查

功能基因筛查

精准医疗研究与应用

新致病位点发掘

技术原理

农口:QTL精细定位区间重测序

辅助QTL定位候选基因选择

候选基因自然变异分析

翼和特色

·              自主知识产权的超高重PCR为基础,技术先进,结果准确

·              自主引物设计及优化平台,保证测序结果特异性及均一性

·              针对每个客户的研究目标,灵活定制研究方案

·              超高重PCR引物设计灵活,只需提供目标区域相关信息和参考基因组信息

·              平均测序深度>100X,一般在1000×左右或以上。

·              Q30>90%

·              测序有效覆盖度90%以上(有效覆盖度深度>30×以上的片段比例)

·              准确率>98%

数据分析内容

·              测序数据质量评估

·              测序覆盖度和深度报告

·              数据比对,变异分布统计

·              SNP/InDel检测、统计、注释

上海翼和应用生物技术有限公司

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