目标区段重测序
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Hi-Reseq 二代目标基因/区段重测序

重测序背景介绍

在后基因时代,对基因组候选区段或候选基因的重测序的需求日益增加,候选区段范围在5K-200K之间,采用传统的Sanger测序或目标区域杂交捕获测序价格昂贵。因此基于超高重PCR的扩增子捕获测序应对该长度范围内的使用性强,针对连续区段,外显子靶标以及客户指定位点,特异性设计扩增引物,经过引物优化及修饰,多重PCR一次性捕获所有位点。

上海翼和生物目标区段重测序服务采用翼和自主研发的多重PCR技术,克服扩增效率不均一问题,保证扩增子间拷贝数差异控制在平均深度测序深度0.2X以上。

相比全基因组测序,全外显子组测序,目标基因/区段测序更加灵活、经济、高效。

 

上海翼和生物重测序服务原理

实验原理

1、设计多重PCR引物,从基因组DNA中扩增目标区域序列

2、优化多重PCR反应,使目标区域能够均匀覆盖

3、扩增目标区域,加测序接头,不同样本加上不同index区分

4、利用高通量测序平台对目标区域进行深度测序

5、生物信息学分析,找出目标区域中的多态或突变位点

上海翼和生物重测序服务流程

 

翼和特色

内容

Hi-ReSeq  重测序服务

翼和自主知识产权的超高重PCR为基础,技术先进,结果准确

自主引物设计及优化平台,保证测序结果特异性及均一性

针对每个客户的研究目标,灵活定制研究方案

超高重PCR引物设计灵活,只需提供目标区域相关信息和参考基因组信息,无物种界限

平均测序深度100X95%扩增子的测序深度在平均深度的0.2X以上

测序有效覆盖度95%以上

准确率>98%

 

质控

内容

定量PCR质控结果

覆盖度均一性

d1dd44edb6c3ce40baf251a4532f79e

 

数据分析

内容

1

测序数据质量评估

2

测序覆盖度和均一性分析

3

数据比对,变异分布统计

4

SNP/InDel检测、统计、注释

 

Hi-Reseq技术参数

优势

指标

 

优势

指标

样本DNA

40ng/ul

 

均一性

95%扩增子测序深度在平均深度的0.2X以上

检测区间

5-200Kb

 

覆盖度

平均测序深度100×100%扩增子覆盖

反应重数

20-300

 

重复性

~100%

扩增子长度

200bp

 

质控标准

Q30>90%

 

样本要求

l  若样品为基因组DNA,要求:DNA浓度≥40ng/ul,体积>20ul。纯度OD 260/OD280 1.82.0之间。

l  若分型样品为血样,样本要求:血液样品,体积大于500ul,需用抗凝剂抗凝,送样过程中请注意保持低温,防止DNA降解。提取DNA将收取DNA提取费。

l  客户在寄送样品的时候,应在送样包裹中放置足量的冰袋,以减少在运输过程中因温度变化导致DNA降解的可能。

l  提供片段序列信息,被选区域可以是连续的基因组序列,也可以是独立片段或外显子序列。

 

遗传性疾病的筛查和诊断

    孟德尔遗传疾病又称单基因疾病,是新生儿出生缺陷的重要原因之一。截至2016年,已经发现的单基因遗传病多达4000多种,致病基因3000多个。人的基因平均长27kb,传统的sanger测序法很难实现低成本快速筛查。目标区域捕获测序很好的解决了这一难题,通过多重PCR对扩增整个基因区域,一次性捕获,结合高通量测序技术,多样本同时测序,在大样本量筛查的同时极大的降低成本。

 

复杂疾病致病基因筛查

     除孟德尔遗传疾病以外,大部分疾病有着更为复杂的遗传机制。像肿瘤、心脑血管疾病等都是复杂的多基因疾病,这些基因往往由多个基因以及环境的相互作用所控制,每个基因对于基因的发生发展起了微效作用。通过全基因组关联分析、外显子组测序、全基因组测序等研究,我们已经知道许多相关的基因/区域与疾病相关。通过对疾病相关基因富集后测序,降低了测序费用,可在同样的研究经费下增加样本量,获得有统计学意义的结果。针对癌症相关的热点基因热点区域的捕获,可以低成本地获得高深度测序结果,发现低频率突变,帮助临床研究专家进行新的科学发现和有意义的临床方案开发。

 

辅助QTL候选基因定位

     QTL定位是动植物复杂性状研究的重要方向,通过遗传群体的分析,可以将候选基因定位于特定区间内,通过扩大群体方法进行精细定位往往费时费力,这些区域一般长达几百kb甚至几Mb,包含较多的基因。目标区域重测序可以一次获得QTL区域内的基因序列,经过序列差异分析及基因功能预测,可有效的帮助遗传学家快速确定候选基因。

 

功能基因筛查

         对功能性状或代谢途径的研究会涉及到一系列基因,如何选择其中的重要基因进行研究是关键。对相关途径中的所有基因进行捕获测序,结合序列和功能的分析,可以预测基因的功能与作用,为下一步的功能研究奠定基础。尤其适合于非模式生物自然群体中的功能基因组学研究。

 

精准医疗研究与应用

       不同病人对于药物的代谢能力、敏感性、耐受性不同,不合适的用药会导致效果不佳甚至不良药物反应。通过全面筛查病人药物反应相关基因多态(突变)情况,可指导病人合理用药。例如通过对癌症基因进行测序,可制定针对性治疗方案,选择相应的靶向药物,降低病人治疗费用,避免无效用药和随之而来的副作用。